無秩序な核輸送機構をその場で可視化

Nature volume 617、pages 162–169 (2023)この記事を引用

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214 オルトメトリック

メトリクスの詳細

約 120 MDa の哺乳類の核孔複合体 (NPC) は、核とサイトゾル間の輸送のゲートキーパーとして機能します1。 NPC の中央チャネルは、FG ヌクレオポリン (FG-NUP) と呼ばれる数百の本質的に無秩序なタンパク質 (IDP) で満たされています 2,3。 NPC 足場の構造は驚くほど詳細に解明されていますが、FG-NUP によって構築された実際の輸送機構（約 50 MDa）は、高分解能の断層像や人工画像で計算された構造でも約 60 nm の穴として描写されます。知能4、5、6、7、8、9、10、11。 今回我々は、合成生物学を利用した部位特異的小分子標識法と高時間分解蛍光顕微鏡を組み合わせて、生細胞および無傷の輸送機構を備えた透過処理された細胞内のNPC内部の重要なFG-NUP98の立体構造を直接調べた。 FG-NUP98セグメントの距離分布の単一透過細胞測定とNPCの粗粒分子シミュレーションを組み合わせることで、ナノサイズの輸送チャネル内部の未知の分子環境をマッピングすることができました。 私たちは、このチャネルがフローリーポリマー理論 12 の用語で言えば「良溶媒」環境を提供していると判断しました。 これにより、FG ドメインは拡張された立体構造をとり、核と細胞質の間の輸送を制御できるようになります。 プロテオームの 30% 以上が IDP から形成されているため、私たちの研究は、細胞シグナル伝達、相分離、老化、ウイルス侵入などのさまざまなプロセスにおいて重要である IDP の障害と機能の関係を in situ で解決するための扉を開きます。

IDP は、固定された三次構造を持たない柔軟で動的な高分子であり、細胞全体でさまざまな機能を実行するためにさまざまな構造をとることができます。 IDP は人間の生理機能と非常に関連しており、とりわけ神経変性老化疾患やがんにおいて中心的な役割を果たしています。 IDP は相分離の重要な役割も担っており、生体分子凝縮物の形成に関与しています 13、14、15、16、17、18、19、20、21。 哺乳類では総分子量約 120 MDa のナノサイズ NPC には、FG-NUP として知られるフェニルアラニン (F) およびグリシン (G) 残基が豊富な数百の IDP が存在します1。 FG-NUP は NPC の中央チャネルに透過性障壁を形成し、核局在化配列または核輸送配列を示さない限り、大きな積荷の通過を制限することで核細胞質輸送を調節します 2,3。 核輸送受容体はこれらの配列を特異的に認識し、積荷を効率的にバリアを通過させます。 極低温電子断層撮影法、結晶構造解析、プロテオミクス、および人工知能 (AI) ベースの構造予測の最近の進歩により、中央チャネルを囲む NPC 足場の約 70 MDa が原子に近い解像度で解像されました 4,5,6,7,8 、9、10、11。 しかし、非常に動的な FG-NUP からのシグナルは概して、これらの構造生物学技術ではアクセスできず、中央チャネル内の実際の輸送機構 (さらに約 50 MDa) は捕捉されず、チャネル内に約 60 nm の穴が残ります。足場構造の中心。 その結果、NPC内部のタンパク質の立体構造状態は依然としてとらえどころのないままであり、機能状態におけるFGドメインの形態について、部分的に矛盾するいくつかの仮説が導かれている22、23、24、25、26、27、28。 真核生物のプロテオーム全体の約 30% が本質的に無秩序であるため、細胞内の構造状態を簡単に研究できないという問題は、NPC 生物学をはるかに超えています。 磁気共鳴および散乱技術 13,14 に加えて、精製および標識されたタンパク質の単一分子蛍光は、溶液中のタンパク質の立体構造を調べるための強力なツールとなっています。 先進的な研究では、このようなプローブを微量注入すると、細胞内でこれが可能であることさえ示されています29、30、31。 しかし、NPC は有糸分裂後期および間期の核成長中にのみ組み立てられるため 32、その標識には遺伝的コード化が必要です。 しかし、GFP や SNAP-tag33 などの自己標識タンパク質タグなどの確立された蛍光タンパク質ベースの技術では、蛍光標識のサイズが非常に大きく、本質的にラベル付けの自由が制限されている。